Der Anschluss an Österreich wurde auch in der evangelischen Kirche des Landes nicht nur freudig begrüßt. Auch die evangelische Geistlichkeit war ja ganz im "magyarischen Geist" erzogen worden und hatte in Ungarn einen sehr hohen sozialen Status. Das alte Misstrauen gegen das katholische Österreich, von dem man zumeist Unterdrückung erfahren hatte, wirkte natürlich nach. In einer deutschen Autonomie innerhalb Ungarns sahen auch viele Geistliche die bessere Lösung. Auch in politischer Hinsicht war die protestantische Führungsschicht skeptisch. In Österreich fürchtete man - nachdem man so eben die Rätediktatur überstanden hatte - die Herrschaft der Sozialdemokratie und des kirchenfeindlichen Materialismus. Auch nachdem die Christlichsozialen in Österreich die Mehrheit erlangt hatten war man misstrauisch, da man sie mit dem politischen Katholizismus und dessen Machtansprüche in Verbindung brachte. In Ungarn hingegen wirkten auch evangelische Pfarrer in den Reihen der Christlichsozialen mit, etwa der Agendorfer Pfarrer Edmund Scholtz. In der Person des reformierten Reichsverwesers Horthy glaubte man mehr Entgegenkommen erwarten zu können. Ein weiteres wichtiges Argument auf evangelischer Seite war auch, dass man das Deutschtum in Ungarn nicht schwächen wollte. Die Bevölkerung in den Dörfern war allerdings trotz dieser Bedenken mehrheitlich für den Anschluss an Österreich. Sprachliche und wirtschaftliche Argumente wogen schwerer als konfessionelle Befürchtungen.
Eine Katastrophe für die Evangelischen des Burgenlandes war der Verbleib Ödenburgs bei Ungarn, da die Stadt der Mittelpunkt des evangelischen Lebens war, mit der theologischen Fakultät, dem evangelischen Lyzeum, der Lehrerbildungsanstalt und den vielen evangelischen Schulen. Mit Ödenburg gingen auch die traditionsreichen deutsch - evangelischen Gemeinden in der Umgebung der Stadt - Agendorf, Wandorf, Wolfs, Harkau - verloren, insgesamt etwa 18 000 Evangelische. Auch Ungarisch Altenburg und Güns, die ebenfalls große evangelische Gemeinden hatten, blieben bei Ungarn.
Die an Österreich gefallenen Gemeinden schlossen sich 1922 zu drei Senioraten zusammen. Das südliche Seniorat war das an Gemeinden stärkste, das nördliche Seniorat hingegen umfasste nur vier Gemeinden. Loipersbach blieb zunächst noch Tochtergemeinde von Agendorf, obwohl nunmehr eine Staatsgrenze zwischen den beiden Orten lag. Deutsch Jahrndorf verlor seine große Tochtergemeinde Karlburg. 1923 stimmten die Behörden der Errichtung einer eigenen burgenländischen Superintendenz zu. Im April 1924 wurde der Senior Theophil Beyer, Pfarrer in Oberschützen, zum ersten Superintendenten gewählt. Ihm folgte 1940 bis 1962 Gustav Albert Dörnhöfer.
Die Schlechterstellung der evangelischen Kirche im Vergleich zu Ungarn, die finanziellen Nöte und die Diskriminierung im "Ständestaat" hatten viel Unzufriedenheit und schließlich auch Opposition zum Staat zur Folge, so dass schon früh in vielen evangelischen Gemeinden des Burgenlandes der Anschlussgedanke an Deutschland, die deutschnationalen Parteien und später auch der Nationalsozialismus viel Zustimmung fanden. Sowohl die Großdeutschen wie auch der Landbund hatten in den evangelischen Gemeinden ihre Hauptstützen.
Das konfessionelle Schulwesen bestand im Burgenland bis 1938 weiter. Die staatliche Einflussnahme wurde aber immer stärker, im Lehrerdienstrecht, in der Schulaufsicht und auch in der Finanzierung. Die finanziellen Lasten wurden für die Gemeinden immer größer und waren unter der damaligen wirtschaftlichen Situation kaum mehr tragbar. Die Spannungen in den Gemeinden nahmen zu. Die Lehrer, die vom Presbyterium gewählt wurden, wobei nicht nur die pädagogischen Fähigkeiten, sondern auch die "Kirchennähe" wichtig war, wünschten vielfach eine Herauslösung der Schulen aus der Kompetenz der Presbyterien. Die Kantorlehrer waren zudem noch immer sehr vom Pfarrer abhängig. Zu diesen Spannungen trug auch die zunehmende Ideologisierung der Lehrerschaft bei. Im Juli 1938 wurde dann das konfessionelle Schulwesen abgeschafft. Die Schulgebäude blieben zwar im Kirchenbesitz, mussten aber - oft für eine sehr niedrige Miete - zur Verfügung gestellt werden. Besonders schlimm war, dass die Schulen in den Filialgemeinden auch Bethäuser waren, nunmehr aber für kirchliche Zwecke wie Jugend- und Frauenarbeit oder Religionsunterricht nicht mehr zur Verfügung standen. Ein besonderes Kapitel waren die evangelischen Schulanstalten in Oberschützen, 1921 die einzigen Matura führenden Schulen des Landes. In der Zwischenkriegszeit versuchte man, die Weiterführung zu untergraben, durch finanzielle Aushungerung und behördliche Schikanen. Die finanzielle Situation der evangelischen Kirche und ihrer Gemeinden war in der Zwischenkriegszeit katastrophal. Nur zu 27 % trugen staatliche Subventionen zum Unterhalt bei, der Rest musste durch Verpachtung von Grundstücken, Spenden des Gustav-Adolf-Vereins und eines Unterstützungsvereins aufgebracht werden. Nach dem Anschluss an Deutschland wurden auch diese Schulen der Kirche entzogen. Im Krieg schwer verwüstet, konnte die Lehrerbildungsanstalt erst 1958 wieder errichtet werden, um dann in ein musisch-pädagogisches Realgymnasium umgewandelt zu werden. Die Gründung einer evangelische Pädagogischen Akademie konnte nicht verwirklicht werden.
Mit der Errichtung des Ständestaates begann für die evangelische Kirche eine Zeit der Zurückdrängung. Der Staat orientierte sich an den Interessen der katholischen Kirche, die Evangelischen wurden als Außenseiter gesehen und behandelt. Viele sahen sich in die Zeit vor dem Toleranzpatent und dem Protestantenpatent zurückversetzt, Evangelische wurden verfolgt und von den Behörden schikaniert. Immer wieder sprachen Vertreter des Ständestaates von einer neuen Gegenreformation, die notwendig wäre. Die Geschichte wurde uminterpretiert, die Reformation als "Tragödie" gesehen und Luther ein "katastrophaler Irrtum" unterstellt. Ein Protestschreiben von evangelischer Seite dagegen musste eingestampft werden, der Autor wurde zu einer Geldstrafe wegen "nationalsozialistischer Betätigung" verurteilt. Lediglich anonym konnte in der Schweiz eine Schrift erscheinen, die versuchte, diese protestantenfeindliche Haltung im Ausland zu diskreditieren. In Österreich selbst waren immer mehr Evangelische bereit, das "System" zu bekämpfen und den Anschluss an Deutschland, an das Mutterland der Reformation, herbei zu sehnen. Dass dort der Kampf gegen die Kirchen schon im Gange war, wurde übersehen. Nur wenige Pfarrer standen auf der Seite des Ständestaates. Evangelische Einrichtungen dienten vielfach auch der Tarnung illegaler nationalsozialistischer Aktivitäten. Nach dem Juliputsch von 1934 wurde evangelischen Pfarrern die Begünstigung oder gar Beteiligung vorgeworfen. Einige Pfarrer wurden in Untersuchungshaft genommen, mussten aber nach einigen Wochen wieder freigelassen werden. Der Superintendent des Burgenlandes, Theophil Beyer, musste sich täglich am Gendarmerieposten melden - eine Demütigung nicht nur für ihn, sondern auch für die burgenländischen Evangelischen.
Das Verhältnis zum Ständestaat wurde noch schlechter durch eine Übertritts- bzw. Kircheneintrittswelle. 1934 waren ja viele Sozialdemokraten und bald auch Nationalsozialisten aus der katholischen Kirche ausgetreten. Nun verordnete der Ständestaat, dass jeder, der im öffentlichen Dienst beschäftigt werden wollte, einer christlichen Kirche angehören musste. Dabei war natürlich an die katholische Kirche gedacht. Viele suchten aber bei der evangelischen Kirche um Aufnahme an, allein im Jahre 1934 25 000 Personen. Im Burgenland fiel diese Übertrittsbewegung kaum ins Gewicht, trug aber auch hier zur Verschlechterung des Klimas bei. Schließlich wurden für alle Übertrittswillige eine Gewissenskommission zuständig, die den "Geisteszustand" überprüfen sollte. Die Behörden zögerten die Bewilligungen hinaus oder verweigerten sie. 1934 wurden im Bezirk Knittelfeld von 519 Übertrittserklärungen nur 66 bewilligt. Schuschnigg nannte die Übertretenden "Trutzprotestanten". Die Diskriminierung der Evangelischen nahm auch im Burgenland zu. Sie wurden vielfach aus den "Gemeindetagen" verdrängt. sogar in mehrheitlich evangelischen Orten. Gegen Lehrer an evangelischen Volksschulen gab es allerlei Schikanen, wobei der konfessionelle und der politische Druck miteinander verflochten waren. In Oberschützen wurde etwa dem Superintendenten verboten, zu unterrichten.
Die Frage, ob die Evangelischen in der Vaterländischen Front mitarbeiten sollten, wurde mit der Forderung nach einer Kirchenverfassung verbunden. Auch der Oberkirchenrat, der ja noch immer eine staatliche Behörde war, sollte abgeschafft werden und der Weg freigemacht werden für eine Generalsynode und eine Bischofswahl. Der "Notbischof" und Wiener Superintendent Heinzelmann verhandelte darüber mit der Regierung, die aber diese offenen Fragen immer länger hinauszögerte. Viele Evangelische waren gegen ein Nachgeben und gegen die Verhandlungen. Das Problem war dabei freilich, dass Beamte und Lehrer der Vaterländischen Front beitreten mussten. Heinzelmann gelang es schließlich, in zähen Verhandlungen mit Guido Zernatto einen Kompromiss zu finden und sogar, die Spannungen innerhalb der evangelischen Kirche, wo die Gegnerschaft zum "System" längst überwog, zu übertünchen.
Im Burgenland war die Bereitschaft der Evangelischen, in der Vaterländischen Front aktiv mitzumachen, bescheiden. Lediglich August Moritz Ratz, Superintendentialkurator, Regierungskommissär und "ständischer" Bürgermeister von Rust, der die Evangelischen im ständischen Landtag vertrat, machte einen vergeblichen Versuch der Verständigung.
Mit seinem Neujahrshirtenbrief von 1938, in dem er auf die Gefahren für den Protestantismus in Deutschland hinwies, geriet Heinzelmann in Gegensatz zu den Nationalsozialisten in der Kirche. Heftige Proteste wurden erhoben, vor allem von Gemeinden, die den Deutschen Christen nahe standen. Heinzelmann trat schließlich als Vertrauensmann zurück. Als der Oberkirchenrat zur Teilnahme an der Schuschnigg - Abstimmung aufrief wurde er ebenfalls zum Rücktritt gezwungen. Dr. Robert Kauer, bekennender Nationalsozialist und vorübergehend eingekerkert, wurde mit der Fortführung der Geschäfte betraut, Dr. Hans Eder, seit 1937 Superintendent von Oberöstereich, mit den geistlichen Amtsgeschäften. Ab 1940 trug er den Titel Bischof.
Kauer begrüßtein einem Telegramm Adolf Hitler mit den Worten: "Im Namen der mehr als 330.000 evangelischen Deutschen in Osterreich begrüße ich Sie auf österreichischem Boden. Nach einer Unterdruckung, die die schrecklichsten Zeiten der Gegenreformation wieder aufleben ließ, kommen Sie als Retter aus fünfjähriger schwerster Not aller Deutschen hier ohne Unterschied des Glaubens. Gott segne Ihren Weg durch dieses deutsche Land, Ihre Heimat"
Auch im Burgenland war die Begeisterung nach dem Einmarsch der deutschen Truppen überwältigend. Im Burgenländischen Kirchenboten vom April 1938 hieß es: "Es wird wohl kaum eine evangelische Gemeinde in unserem Burgenland gegeben haben, in der nicht am 13. März 1938 das Lied aufgeklungen wäre: Nun danket alle Gott, mit Herzen, Mund und Händen ...Finstere Mächte waren am Werk, Lüge machte sich breit. Unser Volk sollte für alle Zeiten entzweit und voneinander getrennt bleiben. Mit Unterdrückung und Entrechtung wollte man ein Neues bauen. Das alles liegt hinter uns! Das deutsche Volk in Österreich ist wieder heimgekehrt! Die tiefe Sehnsucht, die uns Burgenländer seit dem Anschluss an Österreich bewegte, ist nun erfüllt. Unser Ziel und unser war schon damals, als die Loslösung von Ungarn geschah, nicht Österreich, sondern Deutschland."
In der nationalsozialistischen Zeit wurden 66 Volksschulen und die Oberschützener Anstalten beschlagnahmt, die kirchlichen Vereine aufgelöst. Alle diakonischen Einrichtungen wurden von der "Volkswohlfahrt" übernommen, das Vermögen der aufgelösten Frauenvereine der NS-Frauenschaft übergeben. Der Religionsunterricht durfte ab 1940 nicht mehr in den Schulen abgehalten werden, der "Konfessionsunterricht" musste in den Pfarrhäusern und Sakristeien abgehalten werden, fand aber wenig Zuspruch. Über die der Kirche gehörenden Schulgebäude wurden 1940 Mietverträge abgeschlossen, die Kirche erhielt wieder das Recht, dort Gottesdienste abzuhalten. Manche Pfarrer, die schon in der illegalen Zeit Parteimitglieder waren, wurden aus der NSDAP ausgeschlossen. Die Befreiung von den Kirchenzuchtmaßnahmen wurde von vielen evangelischen Christen auch positiv gesehen. Gegen die Enteignung der Schulen gab es auch Widerstand, etwa durch den Pfarrer Johann Schmidt in Großpetersdorf und südburgenländischer Senior in einigen Artikeln im Kirchenboten. Diese fanden das Missfallen des Reichsministers für Volksaufklärung und Propaganda. Der Oberkirchenrat wurde gewarnt und Maßnahmen gegen den Kirchenboten angedroht. Im März 1939 wurde allen Lehrern verboten, kirchliche Funktionen zu übernehmen, später auch allen Hoheitsträgern, also allen Mitarbeitern der Partei.
1943 waren 12 von 29 Pfarrern beim Militär. 1940/41 erreichten die Austrittszahlen ihren Höhepunkt. Insgesamt traten 839 Personen aus. Das waren allerdings nur 2 % der Angehörigen der Diözese. Besonders viele evangelische Lehrer traten aus der Kirche aus. Am höchsten war deren Anteil mit 20 % in Deutsch Kaltenbrunn. Immer mehr Neugeborene wurden nicht mehr getauft, die Zahl der kirchlichen Eheschließungen ging zurück. Im Jahresbericht 1943 wurde die antikirchliche und antichristliche Beeinflussung der Schuljugend durch die Lehrerschaft, besonders durch die früheren evangelischen Lehrer, im südlichen Seniorat beklagt.
Gegen Kriegsende wurde die Frage der Evakuierung in einigen evangelischen Gemeinden heftig diskutiert. Zu Evakuierungen kam es nur in Engerau, Nickelsdorf, Zurndorf und Lutzmannsburg.
Nach der Besetzung durch die Rote Armee wurden viele Pfarrhöfe geplündert, die Pfarrerfamilien vertrieben. Die Einquartierungen in den Pfarrhöfen gab es vereinzelt bis 1947. In Oberschützen wurden zwei Personen erschossen, zwei zu Tode gefoltert, 35 - 40 % der Frauen waren nach Vergewaltigungen infiziert, eine Frau starb daran. Einige Personen wurden von den Russen verschleppt, darunter der einzige Sohn des Superintendenten Beyer. Er kehrte nicht mehr zurück.
Auch viele evangelische Kirchen waren schwer beschädigt, etwa die Filialkirche in Neufeld. Die Kirche in Eltendorf wurde total zerstört. In Allhau wurden Kirche und Pfarrhaus verwüstet. Viele Kirchenbücher und Archive verbrannten. Die Schulen, auch die Oberschützener Anstalten, waren verwüstet. Viele Orte hatten keinen Pfarrer. Die Pfarrer waren gefallen oder vermisst. Der Vikar von Kukmirn wurde von den Russen verschleppt. Auch er kehrte nicht mehr zurück. Der reformierte Kurator von Oberwart wurde, zusammen mit zwei seiner Presbyter, in einem Wald bei Oberwart erschossen.